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breve descripción:

 

2.1. Preparación de SDE

Los rizomas de SD se adquirieron como hierba seca de Hanherb Co. (Guri, Corea). El material vegetal fue confirmado taxonómicamente por el Dr. Go-Ya Choi del Instituto Coreano de Medicina Oriental (KIOM). Un espécimen de referencia (número 2014 SDE-6) se depositó en el Herbario Coreano de Recursos Herbales Estándar. Los rizomas secos de SD (320 g) se extrajeron dos veces con etanol al 70 % (con reflujo de 2 h) y el extracto se concentró a presión reducida. La decocción se filtró, liofilizó y almacenó a 4 °C. El rendimiento del extracto seco a partir de la materia prima cruda fue del 48,13 % (p/p).

 

2.2. Análisis cuantitativo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

El análisis cromatográfico se realizó con un sistema HPLC (Waters Co., Milford, MA, EE. UU.) y un detector de matriz de fotodiodos. Para el análisis HPLC de SDE, el prim-OEl estándar de glucosilcimifugina se adquirió del Instituto Coreano para la Promoción de la Industria de la Medicina Tradicional (Gyeongsan, Corea), ysec-O-glucosilhamaudol y 4′-O-β-D-glucosil-5-OLos compuestos -metilvisaminol fueron aislados en nuestro laboratorio e identificados mediante análisis espectrales, principalmente por RMN y EM.

Las muestras de SDE (0,1 mg) se disolvieron en etanol al 70% (10 mL). La separación cromatográfica se realizó con una columna XSelect HSS T3 C18 (4,6 × 250 mm, 5μm, Waters Co., Milford, MA, EE. UU.). La fase móvil consistió en acetonitrilo (A) y ácido acético al 0,1 % en agua (B) a un caudal de 1,0 mL/min. Se utilizó un programa de gradiente de varios pasos de la siguiente manera: 5 % A (0 min), 5–20 % A (0–10 min), 20 % A (10–23 min) y 20–65 % A (23–40 min). La longitud de onda de detección se escaneó de 210 a 400 nm y se registró a 254 nm. El volumen de inyección fue de 10,0μL. Se prepararon soluciones estándar para la determinación de tres cromonas a una concentración final de 7,781 mg/mL (prim-O-glucosilcimifugina), 31,125 mg/mL (4′-O-β-D-glucosil-5-O-metilvisaminol), y 31,125 mg/mL (sec-O-glucosilhamaudol) en metanol y se mantuvo a 4°C.

2.3. Evaluación de la actividad antiinflamatoriaIn vitro

2.3.1. Cultivo celular y tratamiento de muestras

Las células RAW 264.7 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) y se cultivaron en medio DMEM que contenía 1 % de antibióticos y 5,5 % de FBS. Las células se incubaron en una atmósfera humidificada de 5 % de CO2 a 37 °C. Para estimular las células, el medio se reemplazó con medio DMEM fresco y lipopolisacárido (LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, EE. UU.) a 1μg/mL se añadió en presencia o ausencia de SDE (200 o 400μg/mL) durante 24 h adicionales.

2.3.2. Determinación de óxido nítrico (NO), prostaglandina E2 (PGE2), factor de necrosis tumoral-α(TNF-α), y la producción de interleucina-6 (IL-6)

Las células fueron tratadas con SDE y estimuladas con LPS durante 24 h. La producción de NO se analizó midiendo el nitrito utilizando el reactivo de Griess según un estudio previo [12]. Secreción de las citocinas inflamatorias PGE2, TNF-αy la IL-6 se determinó utilizando un kit ELISA (R&D Systems) según las instrucciones del fabricante. Los efectos del SDE sobre la producción de NO y citocinas se determinaron a 540 nm o 450 nm utilizando un Wallac EnVision™lector de microplacas (PerkinElmer).

2.4. Evaluación de la actividad antiosteoartríticaIn Vivo

2.4.1. Animales

Se adquirieron ratas macho Sprague-Dawley (de 7 semanas de edad) de Samtako Inc. (Osan, Corea) y se alojaron en condiciones controladas con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas.°C y% de humedad. A las ratas se les proporcionó una dieta de laboratorio y agua.ad libitumTodos los procedimientos experimentales se realizaron de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Daejeon (Daejeon, República de Corea).

2.4.2. Inducción de OA con MIA en ratas

Los animales fueron seleccionados aleatoriamente y asignados a grupos de tratamiento antes del inicio del estudio (por grupo). Solución MIA (3 mg/50μSe inyectó directamente en el espacio intraarticular de la rodilla derecha L de solución salina al 0,9% bajo anestesia inducida con una mezcla de ketamina y xilacina. Las ratas se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: (1) el grupo de solución salina sin inyección de MIA, (2) el grupo MIA con inyección de MIA, (3) el grupo tratado con SDE (200 mg/kg) con inyección de MIA y (4) el grupo tratado con indometacina (IM) (2 mg/kg) con inyección de MIA. A las ratas se les administró oralmente SDE e IM 1 semana antes de la inyección de MIA durante 4 semanas. La dosis de SDE e IM utilizada en este estudio se basó en las empleadas en estudios previos [10,13,14].

2.4.3. Mediciones de la distribución del peso en las patas traseras

Después de la inducción de OA, el equilibrio original en la capacidad de soporte de peso de las patas traseras se vio alterado. Se utilizó un probador de incapacidad (Linton instrumentation, Norfolk, Reino Unido) para evaluar los cambios en la tolerancia de soporte de peso. Las ratas se colocaron cuidadosamente en la cámara de medición. La fuerza de soporte de peso ejercida por la extremidad trasera se promedió durante un período de 3 s. La relación de distribución de peso se calculó mediante la siguiente ecuación: [peso en la extremidad trasera derecha/(peso en la extremidad trasera derecha + peso en la extremidad trasera izquierda)] × 100 [15].

2.4.4. Medición de los niveles de citocinas en suero

Las muestras de sangre se centrifugaron a 1500 g durante 10 min a 4 °C; luego se recogió el suero y se almacenó a -70 °C hasta su uso. Los niveles de IL-1β, IL-6, TNF-αLos niveles de , y de PGE2 en el suero se midieron utilizando kits ELISA de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.4.5. Análisis cuantitativo de RT-PCR en tiempo real

Se extrajo ARN total del tejido de la articulación de la rodilla utilizando el reactivo TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), se transcribió inversamente a ADNc y se amplificó mediante PCR utilizando un kit TM One Step RT PCR con SYBR green (Applied Biosystems, Grand Island, NY, EE. UU.). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando el sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Grand Island, NY, EE. UU.). Las secuencias de los cebadores y la secuencia de la sonda se muestran en la tabla.1Se amplificaron alícuotas de ADNc de muestra y una cantidad igual de ADNc de GAPDH con la mezcla maestra de PCR universal TaqMan® que contenía ADN polimerasa, siguiendo las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster, CA, EE. UU.). Las condiciones de PCR fueron: 2 min a 50 °C, 10 min a 94 °C, 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C durante 40 ciclos. La concentración del gen diana se determinó mediante el método comparativo Ct (número de ciclo umbral en el punto de cruce entre la curva de amplificación y el umbral), según las instrucciones del fabricante.

Precio FOB:US$0,5 - 9.999 / Unidad

Cantidad mínima de pedido:100 piezas

Capacidad de suministro:10.000 piezas al mes