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Breve descripción:

 

2.1. Preparación de SDE

Los rizomas de SD se adquirieron como hierba seca de Hanherb Co. (Guri, Corea). El material vegetal fue confirmado taxonómicamente por el Dr. Go-Ya Choi, del Instituto Coreano de Medicina Oriental (KIOM). Un ejemplar de referencia (número 2014 SDE-6) se depositó en el Herbario Coreano de Recursos Herbarios Estándar. Los rizomas secos de SD (320 g) se extrajeron dos veces con etanol al 70 % (con reflujo de 2 h) y el extracto se concentró a presión reducida. La decocción se filtró, se liofilizó y se almacenó a 4 °C. El rendimiento del extracto seco a partir de las materias primas crudas fue del 48,13 % (p/p).

 

2.2. Análisis cuantitativo por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

El análisis cromatográfico se realizó con un sistema HPLC (Waters Co., Milford, MA, EE. UU.) y un detector de matriz de fotodiodos. Para el análisis HPLC de SDE, el prim-OEl estándar de glucosilcimifugina se adquirió del Instituto de Promoción de la Industria de la Medicina Tradicional de Corea (Gyeongsan, Corea), ysec-O-glucosilhamaudol y 4′-O-β-D-glucosil-5-O-metilvisaminol fueron aislados en nuestro laboratorio e identificados mediante análisis espectrales, principalmente por RMN y MS.

Las muestras de SDE (0,1 mg) se disolvieron en etanol al 70 % (10 ml). La separación cromatográfica se realizó con una columna XSelect HSS T3 C18 (4,6 × 250 mm, 5μm, Waters Co., Milford, MA, EE. UU.). La fase móvil consistió en acetonitrilo (A) y ácido acético al 0,1 % en agua (B) a un caudal de 1,0 ml/min. Se utilizó un programa de gradiente multietapa: 5 % A (0 min), 5-20 % A (0-10 min), 20 % A (10-23 min) y 20-65 % A (23-40 min). La longitud de onda de detección se escaneó a 210-400 nm y se registró a 254 nm. El volumen de inyección fue de 10,0μL. Se prepararon soluciones estándar para la determinación de tres cromonas a una concentración final de 7,781 mg/mL (prim-O-glucosilcimifugina), 31,125 mg/mL (4′-O-β-D-glucosil-5-O-metilvisaminol) y 31,125 mg/mL (sec-O-glucosilhamaudol) en metanol y se mantuvo a 4°C.

2.3. Evaluación de la actividad antiinflamatoriaIn vitro

2.3.1. Cultivo celular y tratamiento de muestras

Las células RAW 264.7 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) y se cultivaron en medio DMEM con 1 % de antibióticos y 5,5 % de FBS. Las células se incubaron en una atmósfera humidificada con 5 % de CO₂ a 37 °C. Para estimular las células, el medio se reemplazó con medio DMEM fresco y lipopolisacárido (LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, EE. UU.) a 1μSe añadió g/mL en presencia o ausencia de SDE (200 o 400μg/mL) durante 24 h más.

2.3.2. Determinación de óxido nítrico (NO), prostaglandina E2 (PGE2), factor de necrosis tumoral-α(TNF-α) y la producción de interleucina-6 (IL-6)

Las células se trataron con SDE y se estimularon con LPS durante 24 h. La producción de NO se analizó midiendo el nitrito con el reactivo de Griess, según un estudio previo [12]. Secreción de las citocinas inflamatorias PGE2, TNF-αLa IL-6 se determinó mediante un kit ELISA (R&D Systems) según las instrucciones del fabricante. Los efectos del SDE sobre la producción de NO y citocinas se determinaron a 540 nm o 450 nm con un Wallac EnVision.™lector de microplacas (PerkinElmer).

2.4. Evaluación de la actividad antiosteoartritisEn vivo

2.4.1. Animales

Se compraron ratas Sprague-Dawley macho (7 semanas de edad) de Samtako Inc. (Osan, Corea) y se alojaron en condiciones controladas con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas.°C y% de humedad. Se proporcionó a las ratas una dieta de laboratorio y agua.ad libitumTodos los procedimientos experimentales se realizaron de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Daejeon (Daejeon, República de Corea).

2.4.2. Inducción de OA con MIA en ratas

Los animales fueron aleatorizados y asignados a grupos de tratamiento antes del inicio del estudio (por grupo). Solución de MIA (3 mg/50μSe inyectó directamente 1 litro de solución salina al 0,9 % en el espacio intraarticular de la rodilla derecha bajo anestesia inducida con una mezcla de ketamina y xilazina. Las ratas se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: (1) grupo salino sin inyección de MIA, (2) grupo MIA con inyección de MIA, (3) grupo tratado con SDE (200 mg/kg) con inyección de MIA, y (4) grupo tratado con indometacina (IM) (2 mg/kg) con inyección de MIA. Se administró a las ratas SDE por vía oral e IM una semana antes de la inyección de MIA durante 4 semanas. La dosis de SDE e IM utilizada en este estudio se basó en las empleadas en estudios previos [10,13,14].

2.4.3. Mediciones de la distribución del peso soportado por las patas traseras

Tras la inducción de OA, se alteró el equilibrio original en la capacidad de carga de las patas traseras. Se utilizó un comprobador de incapacidad (Linton Instrumentation, Norfolk, Reino Unido) para evaluar los cambios en la tolerancia a la carga. Las ratas se colocaron cuidadosamente en la cámara de medición. Se promedió la fuerza de carga ejercida por la pata trasera durante un periodo de 3 s. La relación de distribución del peso se calculó mediante la siguiente ecuación: [peso en la pata trasera derecha / (peso en la pata trasera derecha + peso en la pata trasera izquierda)] × 100 [15].

2.4.4. Mediciones de los niveles séricos de citocinas

Las muestras de sangre se centrifugaron a 1500 g durante 10 minutos a 4 °C; posteriormente, se recogió el suero y se conservó a -70 °C hasta su uso. Se midieron los niveles de IL-1.β, IL-6, TNF-α, y PGE2 en el suero se midieron utilizando kits ELISA de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.4.5. Análisis de RT-PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN total se extrajo del tejido de la articulación de la rodilla con el reactivo TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), se transcribió de forma inversa a ADNc y se amplificó por PCR con el kit TM One Step RT PCR y SYBR green (Applied Biosystems, Grand Island, NY, EE. UU.). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó con el sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Grand Island, NY, EE. UU.). Las secuencias de los cebadores y la secuencia de la sonda se muestran en la Tabla.1Se amplificaron alícuotas de ADNc de muestra y una cantidad igual de ADNc de GAPDH con la mezcla maestra de PCR TaqMan® Universal que contiene ADN polimerasa, según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster, CA, EE. UU.). Las condiciones de PCR fueron: 2 min a 50 °C, 10 min a 94 °C, 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C durante 40 ciclos. La concentración del gen diana se determinó mediante el método comparativo Ct (número de ciclos umbral en el punto de cruce entre la gráfica de amplificación y el umbral), según las instrucciones del fabricante.

Precio FOB:US$0,5 - 9.999 / Pieza

Cantidad mínima de pedido:100 piezas

Capacidad de suministro:10000 piezas por mes