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breve descripción:

 

2.1. Preparación de SDE

Los rizomas de SD se compraron como hierba seca de Hanherb Co. (Guri, Corea). Los materiales vegetales fueron confirmados taxonómicamente por el Dr. Go-Ya Choi del Instituto Coreano de Medicina Oriental (KIOM). Se depositó un espécimen de vale (número 2014 SDE-6) en el herbario coreano de recursos herbarios estándar. Los rizomas secos de SD (320 g) se extrajeron dos veces con etanol al 70% (con reflujo durante 2 h) y luego el extracto se concentró a presión reducida. La decocción se filtró, liofilizó y almacenó a 4°C. El rendimiento de extracto seco de los materiales de partida brutos fue del 48,13 % (p/p).

 

2.2. Análisis cuantitativo de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

El análisis cromatográfico se realizó con un sistema HPLC (Waters Co., Milford, MA, EE. UU.) y un detector de matriz de fotodiodos. Para el análisis por HPLC de SDE, la principalO-el estándar de glucosilcimifugina se adquirió del Instituto de Promoción de la Industria de la Medicina Tradicional de Corea (Gyeongsan, Corea), ysegundo-O-glucosilhamaudol y 4′-O-β-D-glucosil-5-O-metilvisamminol se aislaron en nuestro laboratorio y se identificaron mediante análisis espectrales, principalmente por RMN y EM.

Se disolvieron muestras de SDE (0,1 mg) en etanol al 70% (10 ml). La separación cromatográfica se realizó con una columna XSelect HSS T3 C18 (4,6 × 250 mm, 5μm, Waters Co., Milford, MA, EE. UU.). La fase móvil consistió en acetonitrilo (A) y ácido acético al 0,1% en agua (B) a un caudal de 1,0 ml/min. Se utilizó un programa de gradiente de varios pasos de la siguiente manera: 5% A (0 min), 5-20% A (0-10 min), 20% A (10-23 min) y 20-65% A (23-40 min). ). La longitud de onda de detección se escaneó entre 210 y 400 nm y se registró a 254 nm. El volumen de inyección fue 10,0μL. Se prepararon soluciones estándar para la determinación de tres cromonas a una concentración final de 7,781 mg/mL (prim-O-glucosilcimifugina), 31,125 mg/mL (4′-O-β-D-glucosil-5-O-metilvisamminol), y 31,125 mg/mL (segundo-O-glucosilhamaudol) en metanol y se mantuvo a 4ºC.

2.3. Evaluación de la actividad antiinflamatoria.In Vitro

2.3.1. Cultivo celular y tratamiento de muestras.

Se obtuvieron células RAW 264.7 de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) y se cultivaron en medio DMEM que contenía 1% de antibióticos y 5,5% de FBS. Las células se incubaron en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37°C. Para estimular las células, el medio se reemplazó con medio DMEM nuevo y lipopolisacárido (LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, EE. UU.) a 1μSe añadió g/mL en presencia o ausencia de SDE (200 o 400μg/ml) durante 24 h adicionales.

2.3.2. Determinación de Óxido Nítrico (NO), Prostaglandina E2 (PGE2), Factor de Necrosis Tumoral-α(TNF-α), y producción de interleucina-6 (IL-6)

Las células fueron tratadas con SDE y estimuladas con LPS durante 24 h. La producción de NO se analizó midiendo nitrito usando el reactivo de Griess según un estudio previo [12]. Secreción de las citoquinas inflamatorias PGE2, TNF-αy la IL-6 se determinó utilizando un kit ELISA (sistemas R&D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los efectos de la SDE sobre la producción de NO y citocinas se determinaron a 540 nm o 450 nm utilizando un Wallac EnVision.™Lector de microplacas (PerkinElmer).

2.4. Evaluación de la actividad antiosteoartritisEn Vivo

2.4.1. animales

Se adquirieron ratas macho Sprague-Dawley (7 semanas de edad) de Samtako Inc. (Osan, Corea) y se alojaron en condiciones controladas con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a°C y% humedad. A las ratas se les proporcionó agua y dieta de laboratorio.ad libitum. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de conformidad con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Daejeon (Daejeon, República de Corea).

2.4.2. Inducción de OA con MIA en ratas

Los animales fueron aleatorizados y asignados a grupos de tratamiento antes del inicio del estudio (por grupo). Solución MIA (3 mg/50μL de solución salina al 0,9%) se inyectó directamente en el espacio intraarticular de la rodilla derecha bajo anestesia inducida con una mezcla de ketamina y xilazina. Las ratas se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: (1) el grupo de solución salina sin inyección de MIA, (2) el grupo de MIA con inyección de MIA, (3) el grupo tratado con SDE (200 mg/kg) con inyección de MIA, y (4 ) el grupo tratado con indometacina (IM-) (2 mg/kg) con inyección de MIA. A las ratas se les administró SDE e IM por vía oral 1 semana antes de la inyección de MIA durante 4 semanas. La dosis de SDE e IM utilizada en este estudio se basó en las empleadas en estudios anteriores [10,13,14].

2.4.3. Medidas de la distribución de carga de peso de las patas traseras

Después de la inducción de la OA, se alteró el equilibrio original en la capacidad de carga de peso de las patas traseras. Se utilizó un probador de incapacitancia (Linton instrumentation, Norfolk, Reino Unido) para evaluar los cambios en la tolerancia al soporte de peso. Las ratas se colocaron cuidadosamente en la cámara de medición. La fuerza de carga ejercida por la extremidad trasera se promedió durante un período de 3 s. La relación de distribución del peso se calculó mediante la siguiente ecuación: [peso en la extremidad trasera derecha/(peso en la extremidad trasera derecha + peso en la extremidad trasera izquierda)] × 100 [15].

2.4.4. Mediciones de los niveles de citocinas séricas

Las muestras de sangre se centrifugaron a 1500 g durante 10 min a 4°C; luego el suero se recogió y se almacenó a -70°C hasta su uso. Los niveles de IL-1β, IL-6, TNF-αy la PGE2 en el suero se midieron utilizando kits ELISA de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.4.5. Análisis RT-PCR cuantitativo en tiempo real

El ARN total se extrajo del tejido de la articulación de la rodilla utilizando el reactivo TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), se transcribió de forma inversa en ADNc y se amplificó por PCR utilizando un kit de PCR TM One Step RT con SYBR green (Applied Biosystems , Grand Island, Nueva York, EE. UU.). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando el sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Grand Island, NY, EE. UU.). Las secuencias del cebador y la secuencia de la sonda se muestran en la Tabla1. Se amplificaron alícuotas de ADNc de muestra y una cantidad igual de ADNc de GAPDH con la mezcla maestra de PCR TaqMan® Universal que contenía ADN polimerasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster, CA, EE. UU.). Las condiciones de la PCR fueron 2 min a 50 °C, 10 min a 94 °C, 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C durante 40 ciclos. La concentración del gen diana se determinó utilizando el método comparativo Ct (número de ciclo umbral en el punto de cruce entre la gráfica de amplificación y el umbral), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Precio FOB:€ 0,5 - 9.999 / pieza

Cantidad mínima de pedido:100 piezas/piezas

Capacidad de suministro:10000 pedazos/pedazos por mes